پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه ارشد درباره دقیقه، (دمایC، سانتریفیوژ، ماری

دی ۸, ۱۳۹۷

محیط براث استریل تلقیح شد.)
– سپس به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد بر روی شیکر انکوباتور در سرعت rpm180 قرار گرفت.
– محیط کشت رشد یافته به یک لوله فالکون 50میلی لیتر(Extragene, USA)تمیز انتقال داده شد و در سرعتrpm 4000 به مدت ده دقیقه سانتریفیوژ گردید(رسوب گیری).
– محلول رویی دور ریخته شد و مرحله قبل مجددا تکرار گردید تا زمانی که تمام 800 میلی لیتر رسوب گیری شود. قبل از رسوب گیری فالکون خالی را وزن نموده و بعد از رسوب گیری دوباره این کار انجام شد تا وزن تر باکتری محاسبه شود.
15میلیلیتر از محلول شماره 1 به 5گرم وزن تر باکتری اضافه شد سپس با دست ضربه زده شد تا زمانی که حل شود (ورتکس میکس)
به منظور حل شدن بهتر و لیز، در بن ماری (دمایC ? 65) به مدت 7 دقیقه قرار داده تا خوب هموژن شود.
2)
اضافه نمودن 1میلیلیتر پروتئیناز kاز استوک g/mlµ100 (استوک اولیه mg/ml20 بود که از این دوباره یک استوک g/mlµ100 تهیه شد که معادل 5میکرولیتر از استوک اولیه در 1000میکرولیتر آب است).قرار دادن در بن ماری (دمایC ? 65) به مدت بیش از یک ساعت(70 دقیقه قرار دادیم).سپس محلول حاصل در دمایC ? 37 به مدت 24 ساعت قرار گرفت.(انکوبه عادی احتیاجی به شیکر ندارد).
3)
محلول حاصل از انکوبه خارج گردید و به آن 2میلیلیتر NaCH3COO,(نمک3مولار) اضافه شد سپس ورتکس میکس صورت گرفت(انقدر ضربه زده تا نمک کاملا حل شود).نمک باعث تسهیل رسوب گذاری lps با اتانل شد.
سپس 40 میلیلیتر اتانول 96% سرد اضافه و چند بار به آرامی اینورت شد.
در فریزر20-درجه به مدت 24 ساعت قرار گرفت.
به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ با سرعت rpm4000 انجام شد.
محلول رویی دور ریخته و رسوب نگهداری شد.
4)
9 میلیلیتر dH2O و1میلیلیتر(نمک3مولار NaCH3COO) به رسوب اضافه شد سپس چند بار با دست ضربه زده شد(vortex)تا زمانی که کاملا حل شود.
20میلیلیتر اتانول سرد اضافه شد و چند بار به آرامی اینورت گردید.
در فریز20- درجه به مدت 24 ساعت نگهداری شد.
به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردید.
مرحله 4 ،(مرحله رسوب گذاری) دوباره تکرار شد. هدف خارج کردن باقی مانده SDS از LPS تهیه شده است.
5)
اضافه نمودن(9ml(Tris-HCL 10mM pH=7/4 و همچنین اضافه نمودن (Sigma DN25-10MG))DNase(100µg/ml ml5/0 و اضافه نمودن ml RNase(25µg/ml)5/0 (به این صورت که از استوک µg/mlRNase25 حدود 25/1میکرولیتر برداشته و در 1000 میکرولیترآب مقطر حل شد و سپس از این استوک 5/0میلی لیتر برداشته و به مخلوط اضافه شد). مخلوط فوق سپس جهت هضم و تخریب نوکلئیکاسیدها به مدت 4ساعت در دمای 37درجه نگهداری شد.
6)
مخلوط پس از اتمام انکوبه در بن ماری (دمایC ? 65) به مدت30 دقیقه قرار گرفت.
فنل90% هم حجم مخلوط اضافه شد و سپس به آرامی10 الی 15 بار اینورت گردید. (فنل به صورت کریستاله بوده که برای تهیه 9گرم در 10سیسی و یا 90 گرم در 100 سیسی حل شد).
در بن ماری (دمایC ?65) به مدت 15 دقیقه قرار گرفت.
سپس در حمام یخ دمایC ?4 درجه به مدت 5دقیقه قرار داده شد.
7)
مخلوط فوق به مدت 15 دقیقه با سرعت rpm4000 سانتریفیوژ گردید.

No Comments

Leave a Reply