پایان نامه ها و مقالات

دانلود پایان نامه ارشد درباره میلی، پروتئین، دقیقه، ریخته

دی ۸, ۱۳۹۷

SDS-PAGE
یکی از روشهای بررسی بیان پروتئین ، روش SDS-PAGE است که برای شناسایی و بررسی کیفیت و کمیت پروتئین مورد استفاده است. SDS-PAGE براساس روش پیشنهادی لاملی (1970) انجام گرفت. برای این منظور از استوک باکتری (که روش تهیه آن را در بالا توضیح داده شد) روی محیط کشت جامدال بی آگار حاوی امپی سیلین کشت خطی داده شد و در انکوباسیون 37 درجه به مدت 18 ساعت انکوبه گردید. سپس 5 کلنی از پلیت تازه رشد کرده به 20میلی لیتر ال بی براث آمپی سیلین دار تلقیح گردید و در انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه ی سانتیگراد با دور rpm170 قرار گرفت. بعد از 4 ساعت و پس از آنکه OD به 8/0رسید به آن IPTG اضافه شد( به ازای هر 1میلی لیتر محیط کشت به ان 2 میکرولیتر IPTG اضافه شد)سپس در همان لحظه یعنی ساعت صفر 2 میلی لیتر از محتوای فلاسک در شرایط استریل به میکروتیوپ 2 میلی لیتری انتقال داده شد. بعد نمونه درrpm 13000 به مدت 5 دقیقه میکروفیوژ شد و محلول رویی کاملا تا قطره اخر دورریخته شد ورسوب به عنوان پروتئین تولید شده در ساعت صفر به یخچال منتقل شد و فلاسک ارلن مایر روی شیکر انکوباتور قرار گرفت.این کار(رسوب گیری باکتری هر 1 ساعت یکبار) در 5 ساعت متوالی انجام شد و به عنوان رسوب تولید شده ی باکتری در ساعات اول و دوم و سوم و چهارم و پنجم در نظر گرفته شد. حال برای بررسی بیان پروتئین در این 5 ساعت ، روی ژل پلی اکریل آمید( SDS-PAG)
به شرح زیر الکتروفورز گردید.

-الکترفورز بر روی ژل پلی آکریل آمید- SDS-PAG
3-9- نحوه آماده سازی جایگاه ژل
پس از آماده سازی صفحات شیشه ای ،صفحات با گیره های مخصوص بسته شد و به صورت عمودی در محل نگه دارنده ی صفحات قرار گرفت.سپس برای تهیه ی ژل SDS-PAGE به سه نوع بافر که در زیر ذکر شده است نیاز است.
بافرهای مورد نیاز: در این روش به سه نوع بافر نیاز است:
الف) بافرجدا کننده 12% :اجزا و مقادیر این بافر در جدول3-1 نشان داده شده است.
ب)بافر متراکم کننده 6%: اجزا و مقادیر این بافر در جدول 3-2 نشان داده شده است.
ج)بافر تانک برای برقراری جریان:اجزا و مقادیر این بافر در جدول3-3 نشان داده شده است.

3-10- روش تهیه بافر جداکننده
ابتدا به استوک آکریل آمید و بیس آکریل آمید آماده شده تریس و SDS و آمونیوم پرسولفات (APS)به مقدار اشاره شده در جدول 3-1 اضافه شد ، سپس حجم محلول با 8/4 میلی لیتر آب مقطر به 15 میلی لیتر رسانده شد و در آخر تمد38 به مقدار ذکر شده در جدول3-1 اضافه گردیدپس از ترکیب مواد زیر، بافر جدا کننده حاصل شده توسط سمپلر در محل موردنظر (بین صفحات شیشه ای)قرار گرفت . پس از قرار گیری بافر جدا کننده بین صفحات شیشه ای 15 دقیقه برای سفت شدن کامل ژل، فرصت داده شد.

جدول3-1 : بافرجدا کننده 12%
مقدار ماده
غلظت ماده
نوع ماده
3ml
30%
Acryl Amid
3ml
0.8%
Bis Acryl Amid
150µl
10%
SDS
150 µl
10%
APS
3.9 ml
1.5M(PH 8-8.8)
Tris
6 µl
Ready to use(Commerical)
TEMED

11-3 روش تهیه بافر متراکم کننده
ابتدا به استوک آکریل آمید و بیس آکریل آمید آماده شده تریس و SDS و آمونیوم پرسولفات(APS)به مقدار اشاره شده در جدول 3-2 اضافه شد،سپس حجم محلول با 1/2 میلی لیتر آب مقطر به 3 میلی لیتر رسانده شد و در آخرتمد به مقدار گفته شده اضافه گردید و در محل قرار گرفتن ژل (بین ضفحات شیشه ای) روی بافر جداکننده که از قبل ریخته و سفت شده،ریخته شد.سپس شانه مخصوص در این ژل(بافر متراکم کننده) بین صفحات شیشه ای گذاشته شد و برای سفت شدن ژل 15 دقیقه به فرصت داده شد.

مطلب مشابه :  پایان نامه با موضوعشبیه‌سازی، مخروطی، سنبه، فرآیند

جدول 3-2 بافر متراکم کننده 6%
مقدار ماده
غلضت ماده
نوع ماده
250µl
30%
Acryl Amid
250µl
0.8%
Bis Acryl Amid
30µl
10%
SDS
30µl
10%
APS
380µl
1M(PH 6.8)
Tris
3µl
Ready to use(Commerical)
TEMED

3-12 روش تهیه بافر تانک
برای تهیه بافر تانک x1، SDS با تریس و آمینواسید گلایسین با مقادیر ذکر شده در جدول3-3 مخلوط شده و با آب مقطر به حجم 1000 میلی لیتر رسانده شد.PH محلول در 3/8 تنظیم شد.

جدول 3-3 بافر تانک
غلضت ماده
نوع ماده
%0.003
Tris (PH8.3)
%0.001
SDS
%14.4
Glycin

3-13- آماده سازی الکتروفورز عمودی
بافر تانک در دو قسمت بالایی و پایینی صفحات شیشه ای حاوی ژل جداکننده و متراکم کننده برای برقراری جریان در ژل ریخته شد.کابل های برقراری جریان در دو قطب،از قطب منفی به قطب مثبت اتصال یافت.سیستم خنک کننده نیز برای جلوگیری از گرم شدن بافرها و خراب شدن نمونه های پروتئینی وصل شد.

3-13-1 آماده سازی پروتئین
رسوب هر کدام از باکتری های گرفته شده در هر 5 ساعت متوالی با 200 میکرولیتر بافر بارگذاری پروتئین مخلوط شد، و در دمای 100 درجه ی سانتیگراد به مدت 5 دقیقه جهت لیز شدن باکتریها و آزاد شدن و دناتوره شدن پروتئینها جوشانده شد. .

3-13-2 بارگذاری پروتئین
مخلوط پروتئین-بافر نمونه گذاری جوشیده شده،با سرنگ همیلتون با دقت در چاهک های مشخص شده بارگذاری شد.سایز مارکر پروتئین(فرمنتاز)39 نیز پس از جوشیدن در 100 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه در چاهک جداگانه و در کنار نمونه های پروتئینی برای تعیین اندازه پروتئین، بارگذاری گردید. با توجه به (شکل 3-1)پس از بارگذاری نمونه ها،و روشن نمودن دستگاه الکتروفورز،نمونه های پروتئینی در ولتاز100 و در 50 میلی آمپر به مدت6 ساعت،الکتروفورز شد.

(شکل3-1)الکتروفورز نمونه های پروتئینی

3-14- رنگ آمیزی ژلSDS-PAGE
3-14-1 ساخت محلول رنگ
روشهای گوناگونی برای رنگ آمیزی ژل SDS-PAGE وجود دارد.اما روشی که در این کار مورد استفاده قرار گرفت،روش سریع و ساده رنگ آمیزی با کوماسی بلو و نیترات نقره است.برای آماده سازی محلول رنگ کوماسی بلو،400 میلی گرم پودر رنگ کوماسی بلو G-250 با 40 میلی لیتر پرکلریدریک اسید 72% مخلوط شد و با آب مقطر حجم آن به 1000 میلی لیتر رسانده شد.سپس محلول رنگ در انکوباتور شیکردار به مدت یک ساعت قرار داده شد.پس از آماده شدن محلول رنگ،با کاغذ صافی،صاف شد و آماده استفاده شد.

3-14-2 نحوه رنگ آمیزی
پس از اتمام الکتروفورز، صفحات شیشه ای باز شد و ژل با احتیاط برداشته شد و در محلول رنگ کوماسی بلو قرار داده شد.محلول رنگ و ژل در ظرف شیشه ای پیرکس،در داخل مایکروویو با توان 100 وات به مدت 5 دقیقه گذاشته شد.سپس محلول خارج شدو در ظرف مخصوص خود برای استفاده در دفعات بعدی رنگ آمیزی ریخته شد.روی ژل با آب مقطر پوشانیده شد و مجددا در مایکرویو با همان توان 100 وات به مدت 5 دقیقه گذاشته شد.سپس آب مقطر دور ریخته شد.این کار تا زمان ظاهر شدن باندهای پروتئینی تکرار شد.قابل ذکر است در این روش باندهای پروتئینی در 5 دقیقه دوم بخوبی قابل تفکیک هستند.
پس از ظاهر شدن باندهای پروتئین، وجود و اندازه پروتئین مورد نظر با سایز مارکر پروتئین مشخص گردید.
رنگ امیزی با نیترات نقره:
1- ژل در ظرف حاوی 100میلی لیتر الکل 10% و 500 میکرولیتر اسید استیک غوطه ور شده و 3 دقیقه به آرامی همزده شد سپس محلول دور ریخته شد.
2- تکرار مرحله قبل یکبار دیگر
3- 2/0 گرم نیترات نقره را باآب مقطر به حجم100میلی لیتر رسانده و پس از حل کردن، بر روی ژل ریخته شد و 15 دقیقه بر روی شیکر با دور آرام قرار گرفت.
4- خارج کردن نیترات نقره و دوبار شستشو با آب مقطر انجام شد.
5- دو گرم سود را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل شد و 1میلی لیتر فرمالدئید به آن اضافه گردید و ژل در آن قرار گرفت و 15 دقیقه بر روی شیکر با دور آرام قرار داده شد.
6- باید در این حالت باندها مشاهده گردد.

مطلب مشابه :  منابع پایان نامه درموردحقوق و دستمزد، داده ها و اطلاعات، رفتار کارکنان، عملکرد کارکنان

3-15- خالص سازی پروتئین نو تر کیب در E.coli
داخل یک ارلن 50 سی سی مقدار 10 سی سی محیط کشت ال بی براث استریل حاوی امپی سیلین ریخته شد بعد 6تا 7 کلنی از پلیت porA تازه کشت شده 16 ساعته به آن تلقیح گردید و روی شیکر انکوباتور با دمای 37 درجه و دور rpm170 به مدت 16 ساعت قرار گرفت. در نهایت محیط کاملا کدر حاصل شد.
مقدار 100 سی سی از محیط کشت ال بی براث استریل حاوی امپی سیلین در هر یک از دو ارلن cc500 ریخته شد، سپس از محیط کشت 16ساعته که کاملا کدر است 5سی سی به هر کدام از دو ارلن اضافه گردید بعد از آن به مدت 2 ساعت در شیکر انکوباتور 37درجه با دور rpm170 قرار گرفت تا OD آن بین 8/0 تا 1شود سپس به آن IPTG اضافه شد (به ازای هر 1میلی لیتر محیط کشت به ان 2 میکرولیتر IPTG اضافه شد) .داخل شیکر انکوباتور به مدت 5ساعت قرار گرفت و سپس هر کدام از 100میلی لیتر با سانتریفیوژ یخچال دار در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور rpm4000 سانتریفیوژ شد و محلول رویی کامل تا قطره آخر کشیده و دور ریخته شد،در نهایت سلول ها نگهداری شد.

3-16- شکستن سلولها برای ازاد سازی پروتئین
ابتدا سلولها ی بدست آمده از مرحله ی بالا در 4میلی لیتر بافر لیز کننده40 کاملا سوسپانسیون شد تا رسوب کاملا حل شود سپس 50 میکرولیتر لیزوزیم به آن اضافه گردید (برای شکستن دیواره سلولی ) و به مدت 30 دقیقه روی یخ قرار گرفت سپس هر دو سه دقیقه یکبار اینورت گردید.بعد از آن 40 میکرولیتر تریتون X100 به آن اضافه و به آرامی مخلوط شد و در داخل یخچال به مدت ده دقیقه قرار گرفت و هر یک دقیقه یکبار آرام آرام داخل یخچال هم زده شد پس از آن با سانتریفوژ یخچال دار در دمای 4 درجه سانتیگراد با دور rpm4000 سانتریفیوژ گردید و محلول رویی برای خالص سازی نگهداری شد.(حاوی پروتئین آزاد شده است).

3-17- خالص سازی با ستون نیکل سفاروز
بصورت دستی با یک سرنگ 5میلی لیتر ستون نیکل-سفاروز ایجاد شد. بدین ترتیب که روی پایه، یک سرنگ 5میلی لیتر بسته شد و ته سرنگ با پشم شیشه پوشانده شدسپس داخل سرنگ 2میلی لیتر نیکل سفاروز ریخته شد تا ته نشین یا پک شود. سپس از بالای ستون یک میلی لیتر محلول واشینگ ریخته شد تا ژل شستشو یابد. وقتی محلول واشینگ از ستون خارج شد از بالای ستون نمونه ی پروتئین ریخته شد و تا خروج کامل همه ی نمونه پروتئین از ستون زمان داده شد .سپس 10میلی لیتر محلول شستشو دهنده ریخته شد تا پروتئین های اضافه را شستشو داده و خارج شود و فقط پروتئین با توالی هیستونی که مد نظر است و به ژل نیکل سفاروز باند شده بماند. بعد میزان 7 میلی لیتر الوشن41 از بالای ستون اضافه گردید و آن را از انتهای ستون به مقدار 1میلی لیتر در هر یک از هفت میکروتیوب جمع آوری شد. پروتئین مورد نظر در این مرحله از ژل جدا گردید که این همان خالص سازی مد نظر است. سپس 280OD: برای هر کدام از هفت میکروتیوب خوانده شد.میزان جذب بدست آمده باید از حداقل به حداکثر پیش رود و در انتها دوباره کاهش پیدا کند. سپس برای آنهایی که جذب بالایی دارند SDS-PAGE گذاشته شد که باید یک باند تک مشاهده گردد. برای نمونه هایی که جذب بالا دارند برد فورد مورد سنجش قرار گرفت.

مطلب مشابه :  تحقیق با موضوعهتک حرمت، قانون مجازات، امر به معروف، اسناد حقوق بشر

3-17-1 مواد مورد نیاز برای تهیه بافرهای خالص سازی

Stock solution A (10X)
NaCL
NaH2PO4
5M
200mM
برای حجم 50 میلی لیتر PH=3.6

Stock solution B (10X)
NaCL
Na2HPO4
5M
200mM
برای حجم 50 م
یلی لیتر PH=7.9

Washing buffer
S.SOLB
S.SOLA
2.62ml
7.38ml
حجم نهایی 100 میلی لیتر PH=6

Elution buffer
S.SOL A
10ml
حجم نهایی 100 میلی لیتر PH=4

Binding buffer
S.SOLB
S.SOLA
9.42ml
0.58ml
حجم نهایی 100 میلی لیتر PH=7.8

3-18 بردفورد
برای سنجش غلظت پروتئین از روش بردفورد استفاده گردید.
از نمونه BSA استوک mg/ml10 درست شد از این استوک با مقادیر زیر رقت سازی گردید:
(100/5و100/10و100/15و100/20و100/30و100/40و100/50و100/60) میکروگرم بر میکرولیتر.
سپس 100 میکرولیتر از هر کدام از نمونه های رقت سازی شدهBSA در داخل 5/2 میلی لیتر از معرف اضافه شد. سپس با دستگاه اسپکتوفتومتر 595 OD= خوانده شد و با اینها منحنی استاندارد رسم گردید. سپس 100 میکرو لیتر از نمونه پروتئینی خالص سازی شده جدا و به 5/2 میلی لیتر از معرف اضافه شد. سپس باید 5تا 10 دقیقه داخل دمای اتاق بماند. بعد از آن 595 OD= خوانده شد.سپس عددهای بدست امده را در معادله منحنی استاندارد جایگزین کرده و غلظت پروتئین مورد نظر سنجیده شد.

3-18-1 تهیه معرف برد فورد
همه ی مواد اشاره شده در جدول (3-4 ) مخلوط و به آرامی هم زده و با آب مقطر به حجم 1 لیتر رسانده شد سپس به مدت سی دقیقه الی یک ساعت روی شیکر انکوباتور قرار گرفت تا کاملا با هم مخلوط شوند سپس رنگ برداشته و صاف گردید.
جدول(3-4 )
اسید فسفریک %85
اتانول %90
Comacy blue G250
ml100
ml50
mg100

3-19- جداسازی LPS بروسلا ملیتنسیس
جداسازی LPS از سویه ی صاف بروسلا ملیتنسیس انجام گردید.ابتدا در محیط مخصوص بروسلا آگار از باکتری بروسلا ملیتنسیس کشت خطی تهیه شد و بعد به مدت سه روز انکوباسیون در 37 درجه سانتیگراد انجام گرفت تا باکتری رشد کند. البته باکتری در7/6PH= رشد می کند. سپس در هر کدام از دو ارلن CC1000 به میزان CC400 محیط مخصوص بروسلا براث ریخته شد. بایستی محیط ها استریل و7/6ph= باشد. سپس چندین کلنی تازه از باکتری به هر کدام از ارلن ها تلقیح شد و به مدت سه روز داخل شیکر انکوباتور 37 درجه قرار گرفت تا باکتری کاملا رشد کرده و محیط ها کدر شوند.
سپس محیط ها به مدت ده دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد و سلولها برای جدا کردن lps نگهداری شد. وزن سلولهای جدا شده بایستی5 گرم باشد.

3-19-1پروتکل جداسازی lps
روش استخراج LPS
1)
– تهیه 500میلیگرم وزن خشک باکتری معادل 5گرم وزن تر باکتری(به این صورت، ابتدا کلنی باکتری به 800 میلی لیتر

No Comments

Leave a Reply