پایان نامه ها و مقالات

پایان نامه با واژگان کلیدی دقیقه، میلی، پروتئین، دمای

دی ۸, ۱۳۹۷
دانلود پایان نامه

داخل 3 میلی لیتر از محیط کشت LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود انکوبه گردید و تقریبأ به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و داخل انکوباتور شیکردار با دور rpm 200 رشد داده شد. سپس به منظور ساب کالچر به میزان 5/0 میلی لیتر از کالچرهای رشد داده شده به داخل 50 میلی لیتر از محیط کشت تازه LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود منتقل گردید و به مدت یک شب در همان شرایط داخل انکوباتور شیکردار قرار گرفت. بعد از این مرحله سلول ها به مدت 10 دقیقه درون سانتریفیوژ با دور rpm5000 گذاشته شدند. سپس رسوب های سلولی حاصل با 1 میلی لیتر از LB تازه بدون آنتی بیوتیک احیا گردیدند و پس از آن به 50 میلی لیتر از محیط کشت تازه LB که حاوی 100 میکروگرم بر میلی لیتر آمپی سیلین بود جهت ساب کالچر انتقال داده شدند. این مرحله تا زمانی که جذب در 600 نانومتر به حدود 1/0 برسد ادامه یافت. از باقیمانده ی رسوب سلولی نیز جهت استخراج پلاسمید در فریزر نگهداری شد. درادامه به منظور رشد بیشتر کالچرها در دمای 37 درجه داخل انکوباتور شیکردار قرار داده شدند تا زمانی که جذب در 600 نانومتر برابر 6/0تا 7/0 شد. به این مرحله فاز رشد لگاریتمی میگویند. سپس از هر کالچر به میزان 500 میکرولیتر داخل میکروتیوپ استریل ریخته شد و در دمای 20- درجه سانتی گراد به منظور نمونه قبل از القا جهت آنالیز SDS-PAGE ذخیره شد. هم چنین به میزان 700 میکرولیتر از کالچر قبل از القا با 300 میکرولیتر ازگلیسرول 50 درصد مخلوط گردید واستوک حاصل با 15 درصد گلیسرول در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری گردید. سپس القای بیان پروتئین ها با اضافه نمودن IPTG به میزان 1 میلی مولار صورت گرفت. پس از هر ساعت که از زمان القای بیان پروتئین گذشت به منظورجمع آوری نمونه بعد از القا جهت آنالیز SDS-PAGE براساس حجم نمونه ی جمع آوری شده در مرحله قبل از القای بیان پروتئین، نرمالایز صورت گرفت. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در سانتریفوژ با دور rpm 5000 قرارگرفتند و سرانجام رسوب سلولی حاصل جهت آنالیز SDS-PAGE برای بررسی پروتئین تولید شده مورد استفاده قرار گرفتند.

مطلب مشابه :  منابع و ماخذ تحقیقاستان کرمان، پوشش گیاهی، آسیای جنوب غربی، دانشگاه شیراز

3-3-2-4- ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 37 درجه سانتیگراد
جهت ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده پس از القا، در نهایت به مدت 10 دقیقه کالچرها در سانتریفیوژ با دور rpm 5000 قرار داده شد و رسوب سلولی حاصل با اضافه نمودن 10 میلی لیتر بافر لیز سلولی احیا گردید و سپس سلول ها به مدت 2 دقیقه با استفاده از سونیکاتور که روی شرایط 20 ثانیه روشن و 20 ثانیه خاموش و بالاترین ولتاژ تنظیم شده بود سونیکیت گردیده و لیز شدند. به منظور آنالیز SDS-PAGE از لایزت سلولی حاصل به میزان 100 میکرولیتر به عنوان لایزت کل سلولی جمع آوری شد و همچنین به مدت 20 دقیقه باقیمانده ی لایزت را در سانتریفیوژ با دور rpm12500 قرارداده شد. به منظور آنالیز SDS-PAGE از لایزت شفاف (soluble fractions) به میزان 20 میکرولیتر جمع آوری و نگهداری شد.

3-3-2-5- روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین
هر نمونه با 40 میکرولیتر آب دیونیزه و60 میکرولیتراز بافرنمونه مخلوط شدند.سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند و همچنین به مدت 15 دقیقه با حداکثر دور سانتریفیوژ شدند. پس از سانتریفیوژ به میزان 20 میکرولیتر از سوپرناتانت هر نمونه درون چاهک های ژل با گرادیان غلظتی 4 تا 12 درصد از پلی آکریل آمید ریخته شد و هم چنین مارکر وزن مولکولی نیز درون یک چاهک قرار گرفت. جهت الکتروفرز ولتاژی برابر با ولت 200 به مدت 35 دقیقه درون میزان مناسبی از بافر الکترود برقرار شد. پس از اتمام الکتروفورز، ژل با بافر رنگ آمیزی به مدت 35 دقیقه رنگ می شود و درآخر با بافر رنگ بر به مدت 30 دقیقه رنگ زدایی صورت می گیرد.

مطلب مشابه :  دانلود پایان نامه ارشد با موضوعاندازه شرکت، شهرت شرکت، قصد استفاده، پرسش نامه

شکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین.

3-3-2-6- ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد

در آنالیز SDS-PAGE جهت ارزیابی حلالیت پروتئین بیان شده در دمای 37 درجه سانتیگراد نمونه ی لایزت کل سلولی با سوپرناتانت لایزت شفاف مقایسه گردید. از آنجا که در این دما پروتئین محلول نبود با تغییر شرایط آزمایش به صورت کاهش دمای رشد باکتری از 37 درجه به 20 درجه سانتیگراد القای تولید پروتئین صورت گرفت. در این روش پس از کشت اولیه و رسیدن به

No Comments

Leave a Reply